2006年4月3日 中华人民共和国农业行业标准 玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法 NY／T 449--2001 Identification purity of maize variety using salting in protein eletrohporesis 1.范围 本标准规定了玉米单交种及亲本的真实性和品种纯度的室内检测方法。 本标准适用于玉米单交种及亲本的真实性和品种纯度鉴定。 2.引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 GB／T 3543.2－1995农作物种子检验规程扦样 GB／T 3543.5—1995农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定 GB 4404.1－1996粮食作物种子禾谷类 3.定义 本标准采用下列定义。 3．1种子真实性 供检品种与文件记录（如标签等）是否相符。 3．2品种纯度 品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。 ［GB／T 3543．5］ 3．3育种家种子 育种家育成的遗传性状稳定的品种或亲本种子的最初一批种子，用于进一步繁殖原种的种子。 4.原理 从玉米种子中提取的盐溶蛋白在聚丙烯酸胺凝胶的浓缩效应、分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下进行分离，通过染色显示蛋白质谱带类型。不同玉米品种由于遗传组成的不同，种子内所含的蛋白质种类有差异，这种差异可利用电泳图谱加以鉴别，从而对种子真实性和品种纯度进行鉴定。 5.仪器设备及试剂 5．1仪器设备 电泳仪（500 V士5 V连续可调、0～400 mA连续可调、额定输出功率200 W）、垂直板夹心式电泳槽、单籽粒粉碎器、天平（感量 0. 01g、0. 001g、0. 0001g各一台）、酸度计、磁力搅拌器、高速离心机（5 000 r／min以上）、电冰箱、电炉、离心管（ 1. 5 mL）、离心管架、移液管（ 10 mL、5mL、2 mL各两支）、微量进样器（ 5～IOO μL）、恒温箱、观片灯等。 5．2试剂 丙烯酸胶、N，N’一亚甲基双丙烯酸胺、乳酸、乳酸钠、甘氨酸、抗坏血酸、硫酸亚铁、氯化钠、蔗糖、甲基绿、基绿、三氯乙酸、过氧化氢、考马斯亮蓝R25O、无水乙醇、正丁醇等（所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水）。 6.溶液配制 6．1电极缓冲液 称取甘氨酸 6.00 g，倒入2 000 mL烧杯中，加入 1800 mL去离子水溶解，用 2.0 ml。乳酸调至pH3.3，再加去离子水定客至 2 000 mL，混匀。 6．2样品提取液 称取氯化钠 5.80 g，蔗糖200.00 g，甲基绿0.1515 g，倒人 I000 mL烧杯中，加去离子水800 ml。溶解，加热至微沸，放至室温，再用去离子水定容至 I000 mL。在 4℃条件下保存。 6.3分离胶缓冲液 取1.43 mL乳酸钠于 I000 mL烧杯中，加去离子水 980 mL，用乳酸调至pH3．0，再加去离子水定容至 IOOO mL，贮于棕色瓶中，在4℃条件下保存。 6．4分离胶溶液 称取丙烯酸胺112.50g，N，N’一亚甲基双丙烯酷胺3.75g，抗坏血酸0. 25g，硫酸亚铁8.Omg，用分离胶缓冲液溶解，再用分离胶缓冲液定容至I000mL，过滤于棕色瓶中，在4℃条件下保存（不超过 14天）。 6．5浓缩胶缓冲液 取O．3O mL乳酸钠于2OO mL烧杯中，加去离子水 90 mL，用乳酸调至pH5.2，再加去离子水定客至IOO mL，贮于棕色瓶中，在4℃条件下保存。 6．6浓缩胶溶液 称取丙烯酸胺 6.00 g，N，N’一亚甲基双丙烯酸胺 1. OO g，抗坏血酸 O.03 g，硫酸亚铁0.8 mg，用浓缩胶缓冲液溶解，再用浓缩胶缓冲液定容至 IOO mL，过滤于棕色瓶中，在4℃条件下保存（不超过 6天）。 6.7 3 ％的过氧化氢溶液 取3O％的过氧化氢 lmL，加 9 mL去离子水，贮于棕色瓶中，在 4℃条件下保存。 6.8染色液 称取考马斯亮蓝R25O 2． OO g，在研钵中用 IOO mL无水乙醇研磨溶解。过滤于棕色瓶中。取 IO mL该溶液，加入到 2OO ml，的 10％（W／V）三氯乙酸溶液中，混匀。 7.电泳操作 7.1样品制备 按 GB／T 3543.2的要求，从送验样品中随机分取玉米种子至少 IOO粒，用单籽粒粉碎器粉碎，放入1.5mL离心管中，用滴管加入与样品体积相同的样品提取液，摇匀，放置 5 min后．再摇一次，3O min后，用离心机离心（5 000r／min）15 min，取上清液用于电泳。 7．2凝胶制备 7．2．1胶室制备 将预先洗净晾干的玻璃板装人胶条中，然后把胶条固定在垂直板电泳槽内，保持水平，短板向正极，拧紧螺栓，备用。 7．2．2封底缝 根据电泳槽大小，取适量分离胶溶液于烧杯中，用微量进样器加入适量3％的过氧化氢溶液（一般每5 mL分离胶溶液加 2O μL， 3％过氧化氢溶液），迅速摇匀，并从长玻璃板外测活玻璃板倒入，振动电泳槽 3次，放平。 7.2.3灌分离胶 底缝封住后，用滤纸条插入两玻璃板之间，吸去团聚合而析出的水；量取分离胶溶液适量，加入3％过氧化氢溶液（～般每 15 mL分离胶溶液加 3％过氧化氢 20μL）迅速摇匀；倾斜电泳槽，将分离胶溶液倒入两玻璃板之间，高度距短玻璃板上沿 1.2 cm；放平电泳槽并在试验台上振动 3次后，迅速加入适量的正丁醇封住胶面。待凝胶聚合后，吸出分离胶表面上的正丁醇，并用去离子水冲洗胶面3次，用滤纸吸干。 7．2．4灌浓缩胶 量取浓缩胶溶液适量，加入 3％过氧化氢溶液（一般每 5 mL浓缩胶溶液加 3％过氧化氢溶液40 μL），迅速搅匀，倒入两玻璃板之间，马上插好样品梳，样品梳底部距分离胶顶部O．5 cm。 7.2.5点样 浓缩胶聚合后，拔出样品梳并将样品槽清理干净，用微量进样器在每个样品槽中加入不同籽粒的样品上清液 15 μL，每点一粒后，都要用去离子水清洗进样器 3次。 7．2．6电泳 加样完毕后，倒入电极缓冲液，上槽电极缓冲液面要高于短玻璃板，下槽电极缓冲液面要高于铂金丝；将电源线正极接上槽，负极接下槽；接通电源，采用 SOO V稳压进行电泳，待甲基绿指示剂下移至胶底部边缘时，关闭电源。 7．2．7卸板 倒出电极液，从电泳槽内取出胶室，卸下胶条，启开玻璃板，取出胶片，浸人染色液中。 7．2．8染色 在 3OC恒温条件下染色 2～4 h。 7.2．9洗板 取出胶片，用O．5％的不加酶洗衣粉水洗净。 8.结果计算 8.1电泳测定值计算 待整个供检样品电泳结束后，在观片灯上鉴定胶片上电泳谱带的特征和一致性，计数供检样品粒数和非本品种粒数，并按式（1）计算电泳测定值足 供样品粒数一非本品种粒数 X（％）＝－－－－－－－－－－－－－×100％ ……………（1） 供检样品粒数 8．2样品纯度值计算 将电泳测定值X代入式（2）回归方程，计算出样品纯度值广，再将．与GB 44O4．l中的纯度值进行比较，判定样品是否合格。 Y＝52．9＋O．46lX ……………………………（2） | 
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